NC|趙永娟教授等發(fā)現(xiàn)構(gòu)象特異性納米抗體——靶向煙酰胺單核苷酸激活狀態(tài)SARM1

摘要
2022年12月9日，香港中文大學（深圳）醫(yī)學院趙永娟團隊及其合作者在Nature Communications（自然-通訊）雜志發(fā)表題為A conformation-specific nanobody targeting the nicotinamide mononucleotide-activated state of SARM1（一種靶向 SARM1 煙酰胺單核苷酸激活狀態(tài)的構(gòu)象特異性納米體）的研究論文。研究人員利用康體生命抗體發(fā)現(xiàn)平臺，用SARM1蛋白免疫羊駝并建立噬菌體庫，通過噬菌體展示技術(shù)篩選出能夠與SARM1激活狀態(tài)構(gòu)象特異結(jié)合的納米抗體Nb-C6。SARM1的激活可導致細胞鈣離子水平升高，與多途徑誘導的周圍神經(jīng)病變有關(guān)。了解 SARM1的激活機制具有重要意義，Nb-C6能夠特異結(jié)合并穩(wěn)定激活狀態(tài)的SARM1，Nb-C6幫助研究者探究了SARM1在激活過程中的結(jié)構(gòu)變化，并可以對細胞中的活性 SARM1 進行成像和定位，提供了在活細胞中操縱 SARM1 的方法。

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前言

軸突退行（Axon degeneration, AxD）是肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病中的一個早期事件。AxD 由軸突 NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) 水平調(diào)節(jié)，軸突損傷后，NMNAT2 快速降解會引起NMN（Nicotinamide Mononucleotide）積累和 NAD 減少，激活SARM1（Sterile alpha (SAM) and Toll/interleukin-1 receptor (TIR) motif containing 1），并最終導致AxD。

SARM1是一種具有多重催化功能的信號酶，具有NAD酶活性并能催化產(chǎn)生cADPR（cyclic ADP-ribose）和NAADP（nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate）。SARM1在神經(jīng)元和多種細胞中表達，主要定位于線粒體外膜，具有自我調(diào)節(jié)特性，是一種潛在的鈣信號轉(zhuǎn)導酶，不僅在 AxD 中發(fā)揮作用，還可能具有其它多種生理功能。SARM1的八聚體結(jié)構(gòu)于2019年被首次報道，NMN 的結(jié)合位點在 ARM 域上已經(jīng)被揭示，但 NMN 激活形式的 SARM1 的結(jié)構(gòu)尚未完全確定，為解決這一問題，趙永娟團隊及其合作者通過羊駝免疫和噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種構(gòu)象特異性納米抗體Nb-C6。

納米抗體來源于駱駝科動物體內(nèi)的重鏈抗體，它是天然存在的最小的具備完整抗原識別能力的抗體結(jié)構(gòu)域。納米抗體具有優(yōu)秀的特性，如體積小、特異性強、穩(wěn)定性高、易于生產(chǎn)、穿透力強以及免疫原性低等，因此它更容易識別常規(guī)抗體無法識別的抗體表位，抵達傳統(tǒng)抗體無法抵達的組織深度，在結(jié)構(gòu)生物學、抗體藥物研發(fā)、分子影像學等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

正文
研究人員為了了解 SARM1激活狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，采取了利用納米抗體(Nb)穩(wěn)定SARM1活性形式結(jié)構(gòu)的方法。研究人員用重組的SARM1與弗氏佐劑混合免疫羊駝。經(jīng)過6輪免疫后，從外周淋巴細胞提取mRNA，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了納米抗體文庫（圖1），利用噬菌體展示技術(shù)篩選到了多條能與SARM1結(jié)合的陽性克隆。其中，Nb-C6能夠特異識別 NMN 激活的 SARM1。

圖1 Nb-C6的研發(fā)流程

研究人員用表面等離子體共振（SPR）技術(shù)測試了在不同濃度配體溶液中Nb-C6與SARM1的結(jié)合情況，在高 NAD 濃度（1.6 mM）下，Nb-C6 與 SARM1 的結(jié)合非常低。隨著配體濃度轉(zhuǎn)變至100 μM NMN，Nb-C6與 SARM1的結(jié)合比例增加到了60%以上，其線性擬合圖和結(jié)合示意圖如圖2所示，表明 NAD / NMN 比率決定了 Nb - C6與SARM1的結(jié)合，Nb-C6能夠特異結(jié)合NMN激活狀態(tài)下的SARM1。

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圖2 Nb-C6指示并促進SARM1的激活

研究人員進一步測試了與mNeonGreen (mNG，一種熒光標記蛋白)融合表達的Nb-C6可視化檢測細胞中激活形式的SARM1的能力。表達了SARM1 的HEK 293 細胞用CZ-48（能夠穿透細胞膜的NMN類似物）處理，成像結(jié)果表明，Nb-C6的結(jié)合在 CZ-48 激活 SARM1 后顯著增加，證實了其構(gòu)象特異性并表明線粒體定位的 SARM1 的激活經(jīng)歷了構(gòu)象變化。此外，作者還發(fā)現(xiàn)Nb-C6單獨在體外可以激活SARM1，但與NMN和兩者一起激活相比效果明顯較弱。他們還證明，在內(nèi)源表達和誘導表達SARM1的兩種HEK 293細胞中過度表達Nb-C6（C6-YFP）導致cADPR水平升高，表明內(nèi)源性和誘導性SARM1分別被激活。在過度表達不相關(guān)Nb的對照細胞中沒有觀察到cADPR的增加。上述結(jié)果充分驗證了 Nb-C6 僅識別 SARM1 的激活形式，最低限度地識別非活性形式，表明 Nb-C6 是激活活細胞內(nèi)源性和外源性 SARM1 的有價值的工具。

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圖3 (a) Nb-C6 對 CZ-48 激活的 SARM1 進行染色，表達SARM1的 HEK293 細胞用 1 μg/mL 多西環(huán)素處理 12 小時，然后用 100 μM CZ-48 處理 6 小時，固定細胞并分別用 C6-mNeonGreen、抗 SARM1多克隆抗體、線粒體染料Tom20染色。水平比例尺：5 μm；（b）Nb-C6 染色和抗 SARM1 染色信號的比率。

為深入了解SARM1的激活機制，研究人員通過冷凍電子顯微鏡獲得了SARM1NMN/Nb-C6 復合物的結(jié)構(gòu)（分別率：2.7 ?），復合物含兩層八聚環(huán)，包含16個SARM1和16個Nb-C6。Nb-C6 主要與 SAM 結(jié)構(gòu)域結(jié)合并在 C 末端二聚化，穩(wěn)定整個結(jié)構(gòu)。SARM1NMN 的整體結(jié)構(gòu)呈“盛開的蓮花”形狀（圖 3a-c），與 SARM1NAD 緊湊的“甜甜圈”結(jié)構(gòu)（圖4）形成鮮明對比。相較于SARM1NAD， ARM-TIR 域作為一個整體從 SAM 域擺動并旋轉(zhuǎn)~139°。NMN 結(jié)合暴露區(qū)域后，SARM1 的這種大構(gòu)象變化被 Nb-C6 識別，說明其僅對 NMN 激活的 SARM1 具有特異性。

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圖4活化和非活化狀態(tài)下 SARM1 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。a–c SARM1NMN/Nb-C6 復合物的結(jié)構(gòu)，（a）頂視圖； (b) 底視圖；(c) 側(cè)視圖; SARM1 和 Nb-C6 顯示為表面模型，ARM 域為綠色，TIR 域為品紅色，SAM 域為黃色，Nb-C6 為灰色，NMN 顯示為紅色球體。d-f SARM1NAD (PDB 7ANW) 的整體結(jié)構(gòu)。（d）頂視圖；（e）底視圖；（f）側(cè)視圖；SARM1 顯示為表面模型，ARM 域為藍色，TIR 域為小麥色，SAM 域為黃色，NAD 顯示為紅色的球體模型。(g) NMN 和 NAD 結(jié)合的 SARM1 疊加的側(cè)視圖。為清楚起見，只有一個 NMN 結(jié)合和 NAD 結(jié)合形式的SARM1顯示為卡通模型，其他結(jié)構(gòu)被淡化，SARM1NMN 復合物中的 Nb-C6 被隱藏。SARM1NMN 的顏色與圖(a–c) 中一樣，SARM1NAD 的顏色與圖 (d–f) 中一樣；ARM 域中的殘基 E60 和 Q81 以及 TIR 域中的 E686 顯示為球體；相應(yīng)殘基的重新定向由黑色箭頭指示。

研究人員通過分析結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，深入的解析了NMN誘導的SARM1激活機制，發(fā)現(xiàn)NMN 結(jié)合位點與 NAD 的結(jié)合位點相同，并通過ARMNMN 和 ARMNAD 之間的結(jié)構(gòu)差異解釋了為何NMN 是激活劑而 NAD 是抑制劑。NMN/NAD 結(jié)合位點處的突變可以消除神經(jīng)元中SARM1對煙酰胺核糖誘導的NMN 積累的反應(yīng)。作者還發(fā)現(xiàn)ARM 域的向內(nèi)彎曲對于 NMN 誘導的 SARM1 激活是必要的。接下來，作者研究了 NMN 誘導的 ARM 彎曲如何導致其從 SAM 域解離，并發(fā)現(xiàn)納米抗體主要與 SAM 域結(jié)合，較小程度上與 ARM-SAM 連接子結(jié)合。Nb-C6 和 SAM 域之間的結(jié)合界面在很大程度上與ARM:SAM 界面重疊（圖 5），這說明 Nb-C6 無法識別非活性 SARM1，因為結(jié)合位點被 ARM 遮蓋了。

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圖5. 從SAM結(jié)構(gòu)域釋放ARM促使了Nb-C6的結(jié)合。（a）以SAM結(jié)構(gòu)域為基準，疊加SARM1NMN 和 SARM1NAD (PDB 7CM6)的結(jié)構(gòu)；ARM和SAM域在SARM1NMN中分別以綠色和金色顯示；在SARM1NAD中分別為藍色和橙色；界面處的關(guān)鍵相互作用殘基以球棍模型顯示， H鍵和鹽橋顯示為紅色虛線。（b）SARM1突變體的活性和NMN響應(yīng)性。（c）顯示了納米抗體的SARM1NMN與SARM1NAD（PDB 7CM6）疊加圖，SAM結(jié)構(gòu)域為黃色，納米抗體為灰色，SARM1NAD和SARM1NMN的ARM結(jié)構(gòu)域分別為藍色和綠色。重疊區(qū)域由紅色虛線突出顯示。

HDX-MS （氫氘交換質(zhì)譜）和 XL-MS（交聯(lián)質(zhì)譜）數(shù)據(jù)表明 NMN 激活的 SARM1 在溶液中經(jīng)歷了一系列 ARM 和 TIR 結(jié)構(gòu)域重排。因此，Nb-C6 穩(wěn)定結(jié)構(gòu)可能代表這種最終激活狀態(tài)的中間體。如圖 6 所示，在這個最終狀態(tài)下，TIR 域從 ARM 脫離并直接與相鄰的 TIR 相互作用，形成多聚體并導致酶促活動。這種構(gòu)象變化與 ARM 結(jié)構(gòu)域重排相結(jié)合，有助于 SARM1 外圍環(huán)的分解。

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圖6 SARM1在非激活和激活狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換模型

小結(jié)
SARM1 因其在軸突退變（AxD）中的作用而受到關(guān)注。SARM1 是 NADase 和自我調(diào)節(jié)信號酶，可生成 cADPR 和 NAADP。SARM1 的激活是由細胞內(nèi) NAD 的減少引起的，可在諸如紫杉醇誘導的周圍神經(jīng)病變情況下發(fā)生； NMN也可激活 SARM1。研究人員發(fā)現(xiàn)了一種構(gòu)象特異性納米抗體Nb-C6，通過多種實驗證明了Nb-C6僅穩(wěn)定并結(jié)合激活狀態(tài)的 SARM1，并利用Nb-C6實現(xiàn)了活細胞中激活狀態(tài)的SARM1的成像與定位。Nb-C6幫助作者獲得了SARM1在激活狀態(tài)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，聯(lián)合HDX-MS 和 XL-MS 方法，深入解析了SARM1的激活機制。納米抗體相較于傳統(tǒng)抗體有更優(yōu)秀的理化性質(zhì)，在生物學和醫(yī)學領(lǐng)域有諸多應(yīng)用。康體生命提供一站式納米抗體發(fā)現(xiàn)服務(wù)，歡迎咨詢與交流！

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