前言
        納米抗體作為一類具有很好應(yīng)用前景的抗體類型，在很多疾病的診斷和治療方面具有優(yōu)勢。然而，其血漿內(nèi)半衰期短的特點(diǎn)限制了其在治療領(lǐng)域的應(yīng)用。半衰期是指從注射完畢開始計(jì)算，到血漿中藥物濃度降至一半所需的時(shí)間（圖1）。本文將探討如何調(diào)控納米抗體的半衰期，以提高其在治療領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

圖1. 半衰期示意圖 [1]

納米抗體相較于傳統(tǒng)抗體，為何半衰期更短？

納米抗體半衰期短的原因主要有兩個(gè)：
1、腎小球?yàn)V過作用導(dǎo)致納米抗體快速從體內(nèi)清除，腎小球過濾蛋白藥物的界限一般在60kDa左右，也就是說，小分子量的抗體片段或衍生物，如納米抗體（15kDa）和scFv（28kDa）甚至Fab（50kDa），都會(huì)通過腎小球的濾過作用從體內(nèi)清除，導(dǎo)致其具有較短的半衰期。其中，納米抗體在所有抗體類型中分子量最小，半衰期往往只有幾十分鐘。 
2、納米抗體缺乏特異性與FcRn結(jié)合的能力，傳統(tǒng)抗體的半衰期通常較長，因其分子量較大，且能夠特異性地與FcRn（neonatal Fc receptor，新生兒Fc受體）結(jié)合。FcRn能夠保護(hù)抗體不被溶酶體降解，隨后抗體隨FcRn轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面失去與FcRn結(jié)合，重新釋放進(jìn)入血漿，從而延長了抗體的半衰期（圖2）[2]。

圖2. FcRn幫助抗體延長半衰期的機(jī)制[2] 

調(diào)控納米抗體半衰期的策略

1、增加分子量：通過融合蛋白,如HSA等，或多聚體結(jié)構(gòu)增加納米抗體的分子量，降低腎臟清除速度；
2、與Fc片段結(jié)合：將納米抗體與Fc片段結(jié)合，以借用FcRn的功能延長其半衰期；
3、聚乙二醇化（PEGylation）：通過聚乙二醇修飾納米抗體，以延長其在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間；
4、脂質(zhì)體包裹：通過納米技術(shù)將納米抗體包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，以提高其穩(wěn)定性和延長半衰期。
目前，進(jìn)入臨床或已上市的納米抗體藥物主要采用了融合Fc、HSA或HSA納米抗體的方式來延長半衰期。

實(shí)例1——通過融合抗HSA納米抗體延長半衰期
1、HSA的特點(diǎn)

圖3. HSA的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 1uor）

        HSA（人血清白蛋白）是人體血漿中含量最豐富、結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，含有585個(gè)氨基酸，分子量約為66.5 kDa。HSA的X射線晶體結(jié)構(gòu)（圖3）表明它是一個(gè)心形分子,主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，缺乏β-折疊。它含有三個(gè)同源結(jié)構(gòu)域DI、DII和DIII，每個(gè)結(jié)構(gòu)域又分為A和B子結(jié)構(gòu)域（DIA、DIB、DIIA、DIIB、DIIIA和DIIIB）。這些結(jié)構(gòu)域通過長且靈活的環(huán)連接。HSA的血漿濃度為約45 mg/ml (0.6 mM)，循環(huán)半衰期長達(dá)20天。當(dāng)納米抗體與HSA結(jié)合時(shí)，它們的流體力學(xué)半徑和分子量會(huì)增加，腎小球過濾減少，體內(nèi)滯留時(shí)間將大大延長。

2、Ozoralizumab

圖4. Ozoralizumab結(jié)構(gòu)示意圖

        目前，已有許多抗腫瘤靶點(diǎn)的納米抗體與抗HSA納米抗體的雙特異性納米抗體被報(bào)道。其中，Ablynx開發(fā)的人源化、三價(jià)的雙特異性納米抗體Ozoralizumab（英文商品名：Nanozora?）在2022年9月于日本獲批上市，可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (RA) 等疾病，這也是全球首款獲批的雙特異性納米抗體[3]。Ozoralizumab（圖4）分子量為38 kDa, 包含3個(gè)納米抗體結(jié)構(gòu)域，其中2個(gè)靶向TNF-α的不同表位，1個(gè)靶向HSA，以延長藥物半衰期。單次給藥后，Ozoralizumab的平均半衰期t1/2為18.2天。

3、JS014

        君實(shí)生物自Anwita Biosciences引入了一種創(chuàng)新型納米抗體JS014，該藥物的活性成分為重組白介素21和抗HSA納米抗體融合蛋白。JS014具有高親和力和特異性，可以選擇性地結(jié)合人IL-21R并激活淋巴細(xì)胞。通過融合抗HSA的單域抗體，JS014成功延長了IL-21的半衰期。目前，JS014正在進(jìn)行晚期惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)。

實(shí)例2——通過與Fc片段結(jié)合延長納米抗體半衰期

1、Fc片段的特點(diǎn)

抗體Fc片段是抗體的常數(shù)區(qū)，其中氨基酸序列在不同類型的抗體中保持不變?？贵w類型由FC片段的特異性結(jié)構(gòu)來決定。與單克隆抗體不同，納米抗體由于缺乏Fc片段，因此無法實(shí)現(xiàn)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒（ADCC）效應(yīng)和血清穩(wěn)定性，這些效應(yīng)需要Fc受體的參與。在自然殺傷細(xì)胞（NK）介導(dǎo)ADCC作用中，F(xiàn)c受體FcγRIIIa（CD16a）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過將納米抗體與Fc片段的重組人源化重鏈抗體形式結(jié)合，可以增加其Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能和血液滯留時(shí)間，但也會(huì)降低其擴(kuò)散優(yōu)勢。選擇IgG1 Fc作為納米抗體的融合片段，是因?yàn)镮gG1與Fc受體蛋白親和能力。

2、KN035

圖5. KN035晶體結(jié)構(gòu)

康寧杰瑞開發(fā)的恩維達(dá)?（KN035）是一種應(yīng)用Fc融合技術(shù)最成功的納米抗體藥物。該藥物是康寧杰瑞自主研發(fā)的PD-L1單域抗體Fc融合蛋白，作為全球第一個(gè)獲批上市的皮下注射PD-(L)1抗體，適用于成人晚期實(shí)體瘤中不可切除或轉(zhuǎn)移性微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）或錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷型（dMMR）的治療。KN035的Fc片段可以使納米抗體形成二聚體，并且延長分子的體內(nèi)半衰期至約200小時(shí)。因此，KN035具有長效性和高度特異性，是一種具有極高臨床應(yīng)用價(jià)值的新型抗體藥物。

3、HLX53

圖6. HLX53的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制示意圖

復(fù)宏漢霖宣自主研發(fā)的HLX53是一種創(chuàng)新型納米抗體藥物[4]，由TIGIT的納米抗體和野生型IgG1的Fc端組成（圖6）。TIGIT是一種免疫檢查點(diǎn)分子，可抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而降低免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊。HLX53采用Fc融合技術(shù)，具有長效性、高度特異性和穩(wěn)定性，可通過靜脈注射或皮下注射等方式給藥。2022年12月9日，HLX53在晚期/轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤及淋巴瘤患者中開展的I期臨床試驗(yàn)完成首例受試者給藥（NCT05394168）。臨床前研究結(jié)果表明，HLX53具有優(yōu)異的腫瘤抑制效果且安全性良好，HLX53具有潛在的治療多種癌癥的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，全球范圍內(nèi)尚無同類抗TIGIT的Fc融合蛋白藥物獲批上市。

實(shí)例3——多價(jià)納米抗體（ES102）

圖7. ES102結(jié)構(gòu)示意圖[5]

多價(jià)納米抗體具有更大的分子量，能夠有效抵抗腎小球的濾過作用?？仆锏牡诙羁贵w藥物OX40抗體ES102（圖7）已經(jīng)申請(qǐng)臨床試驗(yàn)，并已經(jīng)獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局的受理。ES102是繼信達(dá)生物IBI101、麗珠單抗、恒瑞醫(yī)藥SHR-1806之后第四款申請(qǐng)臨床試驗(yàn)的OX40抗體。ES102是一種六價(jià)納米抗體的Fc融合蛋白，通過獨(dú)特的設(shè)計(jì)，即使沒有外源性交聯(lián)，也能夠強(qiáng)力激活OX40通路。據(jù)報(bào)道，相比傳統(tǒng)的二價(jià)或四價(jià)OX40抗體，ES102具有更強(qiáng)的免疫激活能力，并已經(jīng)顯示出顯著的單藥及聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1/PD-L1抗腫瘤藥效。同時(shí)，在臨床前的安全性評(píng)價(jià)中，ES102也展現(xiàn)了良好的安全性特征。目前，ES102正在進(jìn)行臨床I期試驗(yàn)(NCT04991506 & NCT04730843)。

實(shí)例4——通過聚乙二醇化（PEGylation）延長納米抗體半衰期

1、PEG的特點(diǎn)

圖8. 聚乙二醇（PEG）的結(jié)構(gòu)及PEG化的優(yōu)勢[6]

聚乙二醇（Polyethylene glycol，簡稱PEG）由乙二醇聚合形成，屬于聚醚類物質(zhì)，具有較好的水溶性，極低的免疫原性和毒性。PEG化修飾是指將藥物與PEG共價(jià)結(jié)合，以改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和免疫學(xué)特性，提高其治療效果（圖8）。PEG化修飾可以改變藥物的物理化學(xué)性質(zhì)，增強(qiáng)藥物在體內(nèi)的保留時(shí)間，延長半衰期，提高細(xì)胞受體結(jié)合親和力，從而提高腫瘤靶向性，降低不良事件發(fā)生率。PEG還可以提高蛋白質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性，有助于藥物的生產(chǎn)和儲(chǔ)存。因此，PEG被廣泛應(yīng)用于藥物傳遞和藥物修飾技術(shù)中，可以直接與藥物偶聯(lián)，或附著在藥物表面一起封裝于納米材料中。

2、ATN-192

Ablynx開發(fā)的ATN-192是第二代TNFα納米抗體，即PEG修飾的長效版本，是在Ozoralizumab的基礎(chǔ)上開發(fā)而來的。目前，ATN-192已經(jīng)完成了一期臨床試驗(yàn)。

小結(jié)

納米抗體由于分子量小，半衰期短，限制了其在臨床應(yīng)用中的表現(xiàn)。因此，調(diào)控納米抗體的半衰期對(duì)于拓展其在治療領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。目前，已經(jīng)有許多方法可以有效地提高納米抗體的半衰期，如增加分子量、與Fc片段結(jié)合、融合載體蛋白或抗HSA納米抗體、聚乙二醇化和脂質(zhì)體包裹等。部分方法已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段或已獲批上市，我們期待更多的納米抗體藥物能夠推向臨床并且上市，推動(dòng)人類健康事業(yè)的發(fā)展。

[1] https://www.youtube.com/watch?v=HAaj6Lb46o4 & https://www.medicineslearningportal.org/2015/07/drug-handling-introduction.html

[2] Low-Marchelli, J. Quick Facts to Improve Antibody Half-Life Measurements.

[3] Coppieters, K. et al. Formatted anti–tumor necrosis factor α VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen‐induced arthritis. Arthritis & Rheumatism 54, 1856-1866 (2006).

[4] Hua, B. et al. A novel single domain antibody targeting TIGIT for cancer use in combination therapies. Cancer Research 81, 2451-2451 (2021).

[5] https://posts.careerengine.us/p/61b402d913cf194b25c5a79d

[6] https://biopharmaspec.com/biopharmaceuticals/pegylated-proteins/