哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)指南
什么是細(xì)胞培養(yǎng)？
細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從動物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長的過程。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可以來源于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。
原代培養(yǎng)
原代培養(yǎng)的過程指動物的組織或器官從機(jī)體取出后，經(jīng)機(jī)械法或各種酶類（常用胰蛋白酶）和鰲合劑（常用EDTA)處理，使之分散成單個細(xì)胞，加入適量培養(yǎng)基，置于合適的培養(yǎng)容器中，在無菌、適當(dāng)溫度和一定條件下，使之生存、生長和繁殖的過程。
原代培養(yǎng)離體時間短，遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似，適于做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等研究。嚴(yán)格地說即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。一般持續(xù)1一4周。此期間細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。
細(xì)胞系
正常的哺乳動物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特性：
錨地依賴性：細(xì)胞必須負(fù)在固體上或固定的表面才能生長分裂；
血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長因子才能正常生長；
接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長便受到抑制；
形態(tài)依賴性：細(xì)胞成扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；
上述特征使得正常的哺乳動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細(xì)胞成長。而正常細(xì)胞因某些特征的改變而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時的細(xì)胞稱為細(xì)胞系。
培養(yǎng)基
開始工作前，請檢查細(xì)胞系隨附信息，以確定應(yīng)使用的培養(yǎng)基類型、添加劑和建議。
大多數(shù)細(xì)胞系可以使用 DMEM 培養(yǎng)基或含 10％ 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并且可以根據(jù)需要添加 2 mM 谷氨酰胺和抗生素（見下表）。
使用 DMEM 培養(yǎng)基的一般示例：
| 培養(yǎng)基 | 標(biāo)準(zhǔn)量 |
| DMEM - 從 500 mL 瓶中取出 50 mL后，添加其它成分。 | 450 mL |
| 10% 胎牛血清（FBS） | 50 mL |
| 2 mM 谷氨酰胺 | 5 mL |
| 100 U 青霉素/0.1 mg/mL 鏈霉素 | 5 mL |
pH值
大多數(shù)正常的哺乳動物細(xì)胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細(xì)胞株間差異極小。
CO2
生長培養(yǎng)基可控制培養(yǎng)物的pH值，為培養(yǎng)細(xì)胞pH值的變化提供緩沖作用。通常，這種緩沖作用通過添加有機(jī)（例如HEPES）緩沖液或者CO2-HCO3-（碳酸氫鹽）緩沖液實現(xiàn)。
培養(yǎng)基的pH值取決于溶解態(tài)CO2與HCO3-間的精密平衡，因此，空氣中CO2含量的變化會改變培養(yǎng)基的pH值。為此，使用含CO2-HCO3-緩沖液的培養(yǎng)基時必須使用外源性CO2，特別是使用開放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞或者需要在高濃度條件下進(jìn)行細(xì)胞系培養(yǎng)時。雖然大多數(shù)研究人員通常使用的是空氣中CO2濃度為5-7%培養(yǎng)基，但是4-10%濃度的CO2適用于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)實驗。
溫度
細(xì)胞培養(yǎng)的最佳溫度主要取決于分離來源的細(xì)胞宿主的體溫，此外也部分受到解剖部位體溫差異的影響（例如皮膚溫度可能低于骨骼肌的溫度）。與溫度過低相比，細(xì)胞培養(yǎng)時溫度過高是更為嚴(yán)重的問題；因此，往往將培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定為略低于最佳溫度的溫度。
大多數(shù)人類和哺乳動物細(xì)胞系在36°C至37°C下具有最佳生長狀態(tài)。
觀察細(xì)胞
每天用顯微鏡觀察細(xì)胞，以監(jiān)測其健康狀況、生長速度和融合度（被單層細(xì)胞覆蓋的表面積的百分比）。
貼壁細(xì)胞應(yīng)主要附著在培養(yǎng)瓶底部，呈貼壁形態(tài)（取決于細(xì)胞系）并在其膜周圍折射出光線懸浮細(xì)胞應(yīng)呈圓形形態(tài)，并在其膜周圍折射出光線。一些懸浮細(xì)胞可能會結(jié)團(tuán)（可添加 Pluronic PF68 等解離試劑去除結(jié)團(tuán)）。
含酚紅的培養(yǎng)基應(yīng)為粉紅色/橙色（培養(yǎng)基顏色可能會隨CO2環(huán)境發(fā)生變化）。成像時可使用不含酚紅的培養(yǎng)基，避免干擾圖像采集。培養(yǎng)基呈淡黃色表示其呈酸性且 pH 值降低，通常與受到污染或細(xì)胞不健康有關(guān)。
如果出現(xiàn)以下情況，請丟棄細(xì)胞：
細(xì)胞大量脫落（貼壁細(xì)胞系）和/或看起來干癟并呈顆粒狀/深色；
細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)（看起來根本沒有生長）；
接種密度可用于確保細(xì)胞在某一特定日期適合某項實驗，或保留細(xì)胞培養(yǎng)物以備將來使用或作為備份。懸浮細(xì)胞系根據(jù)體積進(jìn)行接種，因此其接種密度以細(xì)胞數(shù)/mL 為計算單位，而貼壁細(xì)胞系則根據(jù)培養(yǎng)瓶表面積進(jìn)行接種，因此其接種密度以細(xì)胞數(shù)/cm2為計算單位。不同的細(xì)胞系通常需要滿足特定的接種密度，因此務(wù)必查看關(guān)于所用細(xì)胞系的指南。
貼壁細(xì)胞系分板時，可以使用特定的細(xì)胞系分板比或接種密度（細(xì)胞數(shù)/cm2）：
分板比為 1：2 時，融合度應(yīng)達(dá)到 70-80％，并可在 1-2 天內(nèi)進(jìn)行實驗；
分板比為 1：5 時，融合度應(yīng)達(dá)到 70-80％，并可在 2-4 天內(nèi)進(jìn)行實驗；
分板比為 1：10 時，融合度應(yīng)達(dá)到 70-80％，并可在 4-6 天內(nèi)進(jìn)行實驗；
分板比基于培養(yǎng)瓶表面積計算，例如：
分裂比為 1:3 時，1 x 25 cm2 培養(yǎng)瓶可以產(chǎn)出 3 x 25 cm2 培養(yǎng)瓶或 1 x 75 cm2
懸浮細(xì)胞系應(yīng)使用特定的細(xì)胞系接種密度（細(xì)胞數(shù)/mL）進(jìn)行維持：
2e5 應(yīng)在 3-4 天內(nèi)進(jìn)行實驗；
1e6 應(yīng)在 1-2 天內(nèi)進(jìn)行實驗；
如果細(xì)胞長時間無人看管（例如公共假日或周末），建議使用低于正常水平的接種密度/分板比。
更換培養(yǎng)基
如果細(xì)胞在幾天內(nèi)生長良好但尚未融合，則需更換培養(yǎng)基，以補(bǔ)充營養(yǎng)并維持合適的 pH 值。細(xì)胞會產(chǎn)生促生長因子，這些因子會被分泌到培養(yǎng)基中，因此更換一半培養(yǎng)基既能補(bǔ)充培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)也能保留這些促生長因子。
傳代培養(yǎng)懸浮細(xì)胞系
查看細(xì)胞系指南推薦的細(xì)胞分板比或傳代培養(yǎng)細(xì)胞密度。
用移液管從培養(yǎng)瓶中將所需量的細(xì)胞懸液吸移至新培養(yǎng)瓶中。
例如：
要達(dá)到 1:2 的分裂比，需要從 100 mL 細(xì)胞懸液中吸出 50 mL。
要達(dá)到 1:5 的分裂比，需要從 100 mL 細(xì)胞懸液中吸出 20 mL。
將所需量的預(yù)熱細(xì)胞培養(yǎng)基加入到新培養(yǎng)瓶中。
傳代培養(yǎng)需要胰蛋白酶的貼壁細(xì)胞系
注意–并非所有細(xì)胞都需要胰蛋白酶化，因為胰蛋白酶化對某些細(xì)胞可能是有害的。胰蛋白酶還可能會誘使某些膜蛋白暫時內(nèi)化，因此設(shè)計實驗時應(yīng)考慮到這一點。在這些情況下，通?？奢p輕地刮除細(xì)胞或使用非常溫和的消化試劑或采用其他替代方法。
準(zhǔn)備就緒后，小心地將裝有所需細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒入廢液罐（盛有約 100 mL 10％ 次氯酸鈉），注意不要滴落，以免增加污染風(fēng)險。
利用無菌技術(shù)，將足量的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）倒入/移液至培養(yǎng)瓶中，以洗滌細(xì)胞并完全除去殘留培養(yǎng)基中的胎牛血清（FBS）。輕輕搖動幾次培養(yǎng)瓶，以沖洗細(xì)胞，然后小心地將無菌 PBS 倒回/移液至廢液罐中。
必要時可以重復(fù)一到兩次（某些細(xì)胞系進(jìn)行胰蛋白酶消化的時間較長，并且需要多次沖洗才能徹底去除殘留的 FBS，從而促進(jìn)胰蛋白酶化）。
用移液管加入足量的胰蛋白酶-EDTA溶液，以覆蓋培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞。
例如：
在 25cm2 培養(yǎng)瓶中，加入約 1 mL 胰蛋白酶- EDTA溶液。
在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中，加入約 5 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
在 175 cm2 培養(yǎng)瓶中，加入約 10 mL 胰蛋白酶-EDTA溶液。
輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，確保胰蛋白酶與所有細(xì)胞接觸。將培養(yǎng)瓶放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中。不同細(xì)胞系的胰蛋白酶化時間不同。為了避免因過度胰蛋白酶化而嚴(yán)重破壞細(xì)胞，必須每隔幾分鐘進(jìn)行一次檢查。
細(xì)胞脫離后（可能需要輕輕敲擊幾下培養(yǎng)瓶），立即向培養(yǎng)瓶中添加一些培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中的 FBS 會使胰蛋白酶失活）
按照所需的分板比，用移液管從該細(xì)胞懸液中將所需體積的細(xì)胞吸移到新培養(yǎng)瓶中。然后向這些培養(yǎng)瓶中添加培養(yǎng)基至所需體積。
例如：
在 25cm2 培養(yǎng)瓶中，加入約 5-10 mL 培養(yǎng)基。
在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中，加入約 10-30 mL 培養(yǎng)基。
在 175 cm2 培養(yǎng)瓶中，加入約 40-150 mL 培養(yǎng)基。
放置細(xì)胞過夜，使細(xì)胞恢復(fù)并重新貼壁。更換培養(yǎng)基，以徹底清除殘留的胰蛋白酶。
請始終用70%乙醇擦拭雙手和工作區(qū)；
將容器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥之前，先用70%乙醇擦其外部；
不要直接從試劑瓶或培養(yǎng)瓶中傾倒培養(yǎng)基和試劑；
使用無菌玻璃或一次性塑料移液管和移液器操作液體時，每只移液管只能使用一次，以避免交叉污染，無菌移液管到使用時才能打開其包裝，移液管應(yīng)存放在作區(qū)內(nèi)；
試劑瓶和培養(yǎng)瓶使用后應(yīng)蓋上蓋子，多孔板應(yīng)用膠帶密封或放入可重復(fù)密封的袋中，以防止微生物和懸浮污染物進(jìn)入；
無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶和培養(yǎng)皿等到使用時才能打開蓋子，不得將其開放暴露在境中，使用后，應(yīng)立即蓋好蓋子；
蓋子取下后，必須開口朝下放置在工作臺面上；
必須使用無菌的玻璃器皿和其他設(shè)備；
進(jìn)行無菌操作時，不要交談、唱歌或吹口哨；
盡可能快速地進(jìn)行實驗，以降低污染風(fēng)險；
