Western blotting，又稱蛋白免疫印跡，是一種廣泛應(yīng)用的分子生物學技術(shù)，主要用于檢測、分析和定量復(fù)雜生物樣本（如細胞裂解液、組織勻漿、血清、尿液等）中特定蛋白質(zhì)的存在、表達水平以及可能的修飾狀態(tài)。

01 基本原理

      Western blot的核心原理是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，結(jié)合蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)和固相免疫檢測技術(shù)，實現(xiàn)對目標蛋白質(zhì)的定性、定量分析。傳統(tǒng)WB步驟分為電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-洗一抗-二抗孵育-洗二抗-曝光八個實驗步驟，需要1-2天才能完成實驗流程，康體生命推出的直標標簽納米抗體（Anti-tag VHH-HRP）系列產(chǎn)品，只需一步抗體孵育，能有效減少實驗時間，最快半天可完成WB實驗，大大提高實驗效率。

適用場景：用Western Blot檢測帶有標簽（HA、MYC、FLAG、MBP、GST、Strep-Tag II，GFP，Mcherry）的融合蛋白。

適用產(chǎn)品：Anti-tag VHH-HRP、Anti-tag VHH-Biotin預(yù)混SA-HRP。

02 具體步驟

1. 蛋白提取與定量：首先從樣本中提取總蛋白質(zhì)，通常采用適當?shù)牧呀饩彌_液破壞細胞結(jié)構(gòu)并釋放蛋白質(zhì)，然后通過BCA法、Bradford法或Lowry法等進行蛋白質(zhì)濃度測定。

2. 電泳分離：使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）依據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量（MW）進行分離，樣本中的蛋白質(zhì)在電場作用下按照大小分布于凝膠的不同位置。

?Tips：電泳時間大約1.5h內(nèi)

3. 轉(zhuǎn)膜：電泳后的凝膠通過電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將分離好的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種疏水性的固相支持物（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，形成“蛋白質(zhì)印跡”。

?Tips:轉(zhuǎn)膜時間約0.5h，根據(jù)蛋白大小、轉(zhuǎn)膜方式等調(diào)整時間

4. 封閉：為了減少非特異性結(jié)合，用含一定濃度的非離子型洗滌劑（如Tween-20）和蛋白質(zhì)（如BSA或脫脂奶粉）的緩沖液對膜進行封閉。

?Tips：可用含5%脫脂奶的TBST/PBST封閉，或選擇商用封閉液，封閉時間2h，或者4℃過夜，延長封閉時間可以減少背景

加入一抗（針對目標蛋白質(zhì)的特異性抗體）孵育，使一抗與膜上的目標蛋白結(jié)合。

5.抗體孵育：倒掉封閉液，加入稀釋好的VHH直標抗體，室溫孵育2h，回收抗體再利用，用TBST或PBST等buffer洗去未結(jié)合的一抗。

?Tips：抗體孵育時間1-2h，也可4℃過夜孵育，孵育時間過長的話可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合，為了背景干凈，可曾加洗抗體次數(shù)

6. 信號檢測與分析：根據(jù)標記物類型選擇相應(yīng)的檢測方法。對于HRP酶標記，常用化學發(fā)光法（ECL）或染料顯色法（如DAB）；對于熒光標記，可直接進行熒光成像。通過成像設(shè)備記錄并量化信號強度，對應(yīng)到蛋白質(zhì)的位置（分子量），從而確定目的蛋白的存在及其相對含量。

?Tips:曝光時間可以多嘗試，發(fā)光弱后可以再次添加發(fā)光液重新曝光

二、應(yīng)用領(lǐng)域

1. 基因功能研究：通過比較不同處理條件下（如野生型與突變型、藥物處理前后、正常與疾病狀態(tài)等）目標蛋白的表達變化，揭示基因調(diào)控機制或蛋白功能在特定生理或病理過程中的作用。

2. 疾病診斷與監(jiān)測：檢測病患體液或組織中特定疾病標志蛋白的表達水平，如癌癥相關(guān)抗原、炎癥因子、自身免疫疾病的抗體等，輔助疾病診斷、預(yù)后評估或治療效果監(jiān)測。

3. 藥物篩選與藥效評價：評估候選藥物對靶蛋白表達或活性的影響，作為藥物作用機制研究和藥效評價的重要手段。

4. 抗體驗證：確認抗體對目標蛋白的特異性和敏感性，用于優(yōu)化實驗條件、確保后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性。

5. 蛋白修飾研究：通過使用特異性識別磷酸化、乙酰化、泛素化等修飾形式的抗體，檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾狀態(tài)的變化，探究其在細胞信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控等方面的功能。

6. 蛋白質(zhì)純度鑒定：對純化得到的重組蛋白進行Western blot分析，確認其純度及正確分子量，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)功能研究提供保證。

03 應(yīng)用領(lǐng)域

1. 基因功能研究：通過比較不同處理條件下（如野生型與突變型、藥物處理前后、正常與疾病狀態(tài)等）目標蛋白的表達變化，揭示基因調(diào)控機制或蛋白功能在特定生理或病理過程中的作用。

2. 疾病診斷與監(jiān)測：檢測病患體液或組織中特定疾病標志蛋白的表達水平，如癌癥相關(guān)抗原、炎癥因子、自身免疫疾病的抗體等，輔助疾病診斷、預(yù)后評估或治療效果監(jiān)測。

3. 藥物篩選與藥效評價：評估候選藥物對靶蛋白表達或活性的影響，作為藥物作用機制研究和藥效評價的重要手段。

4. 抗體驗證：確認抗體對目標蛋白的特異性和敏感性，用于優(yōu)化實驗條件、確保后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性。

5. 蛋白修飾研究：通過使用特異性識別磷酸化、乙?；?、泛素化等修飾形式的抗體，檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾狀態(tài)的變化，探究其在細胞信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控等方面的功能。

6. 蛋白質(zhì)純度鑒定：對純化得到的重組蛋白進行Western blot分析，確認其純度及正確分子量，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)功能研究提供保證。

      綜上所述，Western blot作為一種成熟且靈活的技術(shù)平臺，在生物醫(yī)學研究、臨床診斷、藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，為深入理解蛋白質(zhì)在生命過程中的角色提供了關(guān)鍵信息，康體生命提供的直標標簽納米抗體能節(jié)約實驗時間，助力科研發(fā)展。