1. 采血后整個(gè)細(xì)胞分離過(guò)程要盡可能快速完成。兩個(gè)小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)一般能夠達(dá)到比較理想的分離效果。所以不建議一次分離太大體積的血液。

2. 分離細(xì)胞前首先要稀釋血液樣品，因?yàn)槿械募t細(xì)胞會(huì)發(fā)生聚集，一些PBMC會(huì)被包裹進(jìn)去，與紅細(xì)胞一起沉淀。通過(guò)稀釋血液可以降低這種趨勢(shì)，提高PBMC的回收量。淋巴細(xì)胞的產(chǎn)量和純度在很大程度上取決于紅細(xì)胞去除效率，所以稀釋的步驟非常重要。

3. 蔗糖密度梯度離心的步驟，制動(dòng)力度要降低甚至關(guān)閉，可以減少細(xì)胞分層界面的擾動(dòng)。

4. 離心的溫度一般在18-22度之間。溫度提高（例如37度），紅細(xì)胞更容易聚集，并且把PBMC包裹在里面一起沉淀下來(lái)。溫度降低（例如4度），紅細(xì)胞聚集速度會(huì)降低，但是細(xì)胞分離的時(shí)間會(huì)增加，也會(huì)降低淋巴細(xì)胞的產(chǎn)量。

5. 離心的時(shí)間長(zhǎng)短，取決于管內(nèi)血液樣品的高度，樣品高度越大，需要的離心時(shí)間也就更長(zhǎng)。我們常用的實(shí)驗(yàn)條件是每支50ml離心管內(nèi)有10ml血液樣品，提前用等體積PBS稀釋混勻后，鋪在20ml的細(xì)胞分離液上，每支離心管的總液體體積是40ml，在 1100 xg 離心20 分鐘是比較合適的。離心時(shí)間不變的情況下，管中血樣的高度如果增加，紅細(xì)胞不容易充分沉淀，就會(huì)造成樣品的紅細(xì)胞污染。

6. 分離完成后要給細(xì)胞計(jì)數(shù)。一定體積的血液分離得到的PBMC數(shù)量與羊駝的健康狀態(tài)有關(guān)，健康情況差，體重過(guò)低的羊駝免疫后，等體積外周血提取得到的PBMC數(shù)量較低。我們的經(jīng)驗(yàn)是，正常情況下每50ml羊駝血能采集到1x10⁸~2x10⁸個(gè)細(xì)胞。