GPCR受體技術(shù)的挑戰(zhàn)與突破
G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是細(xì)胞膜上的重要信號受體，參與了細(xì)胞感知外部信號并調(diào)控內(nèi)部反應(yīng)的過程。盡管GPCR在生理過程中扮演著重要角色，但它們并不是“模塊化”的結(jié)構(gòu)。這意味著，改變其配體特異性通常需要依賴繁瑣的結(jié)構(gòu)誘變和定向進(jìn)化，不僅耗時(shí)長，且操作復(fù)雜。為了克服這一局限，Alice Ting教授團(tuán)隊(duì)利用納米抗體設(shè)計(jì)了一種條件性自抑制結(jié)構(gòu)域，通過簡化GPCR的調(diào)控機(jī)制，提供了更為靈活和模塊化的解決方案。
一、創(chuàng)新設(shè)計(jì)：條件性自抑制結(jié)構(gòu)域與納米抗體結(jié)合
這一研究的核心創(chuàng)新在于結(jié)合了納米抗體和條件性自抑制結(jié)構(gòu)域，使得GPCR能夠根據(jù)外部信號精準(zhǔn)激活，而無需經(jīng)過傳統(tǒng)的復(fù)雜修改。條件性自抑制結(jié)構(gòu)域：研究者為GPCR設(shè)計(jì)了一個(gè)條件性自抑制結(jié)構(gòu)域，位于受體的細(xì)胞外N末端，這個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠使GPCR在沒有外部激活的情況下保持抑制狀態(tài)，從而避免受體信號的非特異性激活。
納米抗體的引入：納米抗體是源自駱駝科動(dòng)物的小型抗體片段，具有高親和力和小尺寸的優(yōu)勢。在此研究中，納米抗體被設(shè)計(jì)并融合到GPCR的細(xì)胞外部分。這種納米抗體與GPCR上的自抑制結(jié)構(gòu)域形成了互斥關(guān)系——當(dāng)特定抗原結(jié)合到納米抗體時(shí)，抑制結(jié)構(gòu)域的作用會(huì)被解除，GPCR因此被激活。
圖1. PAGER的基本設(shè)計(jì)
二、多重輸出：精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞行為
一旦這一合成GPCR系統(tǒng)（PAGER）被激活，它可以驅(qū)動(dòng)多種細(xì)胞行為輸出，包括：轉(zhuǎn)基因表達(dá)（PAGERTF）、內(nèi)源性G蛋白通路激活（PAGERG）、實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測（PAGERFL）
轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)（PAGERTF）
PAGERTF系統(tǒng)的目標(biāo)是通過PAGER的激活驅(qū)動(dòng)特定基因的表達(dá)。此系統(tǒng)能夠在細(xì)胞中精確調(diào)控基因的開關(guān)，適用于基因功能研究和基因治療等應(yīng)用。
圖2. PAGERTF系統(tǒng):PAGER驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)
當(dāng)納米抗體與特定抗原結(jié)合后，PAGER系統(tǒng)被激活，從而觸發(fā)與轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。研究人員設(shè)計(jì)了與PAGER系統(tǒng)相連的轉(zhuǎn)基因表達(dá)模塊，可以在PAGER被激活時(shí)啟動(dòng)目標(biāo)基因的表達(dá)。并且為了驗(yàn)證PAGER的模塊化應(yīng)用，研究團(tuán)隊(duì)將抗原結(jié)合的納米抗體替換為針對不同抗原的納米抗體，從而生成能夠感知和響應(yīng)新抗原的功能性受體。他們使用了10種GFP納米抗體和6種mCherry納米抗體，替換了PAGERTF中的GFP納米抗體。結(jié)果表明，最優(yōu)的抗GFP PAGERTF（包含LaG2納米抗體）能夠檢測到低至1.5nM的FP，與已報(bào)道的LaG217（16–19nM）的解離常數(shù)（KD）相符；而最優(yōu)的抗mCherry PAGERTF（含LaM8納米抗體）則能檢測到100nM的mCherry。這兩種PAGER對其他熒光蛋白沒有反應(yīng)，證明了其高度的特異性。
圖3. 在PAGERTF中測試多種GFP和mCherry納米體
實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)（PAGERFL）
PAGERFL系統(tǒng)的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)通過納米抗體響應(yīng)特定抗原時(shí)，快速并實(shí)時(shí)地監(jiān)測細(xì)胞的狀態(tài)變化。當(dāng)納米抗體與抗原結(jié)合時(shí)，PAGER系統(tǒng)被激活，并通過熒光標(biāo)記物提供實(shí)時(shí)的細(xì)胞反應(yīng)反饋。
圖4.PAGERFL用于實(shí)時(shí)熒光檢測細(xì)胞外抗原
內(nèi)源性G蛋白激活系統(tǒng)
PAGERG系統(tǒng)的目的是通過激活內(nèi)源性的G蛋白信號通路來調(diào)控細(xì)胞的生理過程，如增殖、分化、遷移等。通過納米抗體結(jié)合抗原，PAGER系統(tǒng)被激活，從而觸發(fā)G蛋白信號通路的啟動(dòng)。為拓展應(yīng)用，研究團(tuán)隊(duì)探索了將抗原識(shí)別轉(zhuǎn)化為內(nèi)源性G蛋白通路的激活，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞行為。通過優(yōu)化，構(gòu)建了PAGERGq、PAGERGs、PAGERGi和PAGERG12系統(tǒng)。
圖5. PAGERGq、PAGERGs、PAGERGi和PAGERG12的設(shè)計(jì)和激活
研究團(tuán)隊(duì)對四個(gè)PAGERG系統(tǒng)進(jìn)行了多層次的WB、BRET等實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了PAGERG通過抗原識(shí)別激活內(nèi)源性G蛋白通路。此外，利用AF2預(yù)測了PAGERGq的結(jié)構(gòu)，揭示了肌肉毒素（MT1）自抑制作用，以及納米抗體（藍(lán)色）結(jié)合抗原（綠色）后解除自抑制的效果。
圖6. 驗(yàn)證PAGERG偶聯(lián)抗原識(shí)別到內(nèi)源性G蛋白信號的激活
作者進(jìn)一步展示了PAGERG在復(fù)雜場景下的應(yīng)用：PAGERG能夠調(diào)控急性腦切片和原代T細(xì)胞的多種細(xì)胞行為。綜合數(shù)據(jù)表明，PAGERG可響應(yīng)可溶性或細(xì)胞附著抗原，實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元活性、T細(xì)胞遷移等復(fù)雜細(xì)胞行為的重編程，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力
圖7. PAGERG在急性腦片和原代T細(xì)胞中控制多種細(xì)胞行為
